Hif1抑制心肌梗死后ROS诱导的心 - 心肌囊肿专科治疗医院

TUhjnbcbe - 2022/5/21 17:14:00

文章摘要低氧诱导因子（Hif-1）属于bHLH-PAS家族转录因子。低氧条件下，HIF-1a能够激活减少氧耗竭的信号通路，减少活性氧。成人心脏经历周期性缺血，比如运动，高海拔，缺血，心肌细胞肥大，炎症和纤维化等情况，可能与活性氧（ROS）水平增加和氧化损伤有关。HIF-1在心脏中的研究主要集中在心肌细胞，尽管其关键功能在内皮细胞（EC）重塑、缺血预处理，动脉粥样硬化的巨噬细胞中已被阐述，但是HIF-1在心肌成纤维细胞（CFs）中的功能仍然是未知的。澳大利亚张任谦心脏研究所RichardP.Harvey研究组与VaibhaoJanbandhu合作在CellStemCell发表题为Hif-1asuppressesROS-inducedproliferationofcardiacfibroblastsfollowingmyocardialinfarction。本研究通过代谢物检测，scRNA-seq，BulkRNA-seq和基因敲除鼠等进一步研究Hif-1在CFs中的作用。结果1、低氧条件下CFs的代谢表达谱研究者分离小鼠心脏细胞，缺氧探针染色（Pim），SCA1+PDGFRa+CD31-的CFs细胞（S+P+细胞）Pim荧光强度是心脏间质细胞（TIP）的3倍,提示在TIP细胞群中，S+P+细胞的缺氧程度远远高于ECs。与TIP相比，S+P+细胞的线粒体呼吸速率和胞内ATP含量较低，而葡萄糖摄取和胞内乳酸含量较高。MitoTracker染色和qPCR检测发现S+P+细胞线粒体总量低于TIP，结果提示，S+P+细胞更依赖糖酵解而不是线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)来产生能量。S+P+细胞中HIF-1a以及靶向的下游蛋白水平表达也被显著上调。与课题组前期单细胞测序（scRNA-seq）结果一致，PDGFRa+CFs和TIP中HIF-1a以及下游靶标基因群表达占优势。

2、心肌间质祖细胞有较低的线粒体总量

前期研究表明，心肌S+P+细胞在具有间充质干细胞特性的成纤维细胞中富集。为了评估心肌成纤维细胞克隆形成，研究者用MitoTracker染色S+P+细胞，根据荧光强度分选Mitolow,Mitomedium和Mitohigh细胞亚群进行克隆形成和连续传代，结果表明Mitolow与S+P+细胞一致，具有长期的增殖能力，而Mitohigh细胞不能形成克隆，也不能连续增殖；不同亚群细胞通过BulkRNA-seq发现，Mitohigh和Mitolow细胞亚群蛋白合成，组细胞样相关基因下调。结果提示S+P+细胞间代谢是不同的。

3、构建CF特异性敲除HIF-1a小鼠研究者通过基因敲除构建CF特异性敲除HIF-1a小鼠（cKO）,流式分选CFs,WB、免疫荧光和PCR验证HIF-1a敲除效果。来自cKO小鼠心脏的CFs线粒体总量、糖酵解及细胞传代增殖无显著差异。4、CF细胞HIF-1a缺失导致心肌梗死（MI）后促进成纤维细胞增殖野生型和cKO小鼠心肌梗死手术后，EdU和Ki67染色tdTomato+CFs细胞，心肌梗死手术后cKO组梗死区和边界区增殖细胞明显增多，而在tdTomato-CFs和ECs细胞无明显变化。5、cKO小鼠心脏Hif-1a表达与CFs活化敏感性相关scRNA-seq分析cKO和HET假手术小鼠tdTomato+CFs细胞，sham-cKO组早期活化的CF亚群、F-Act亚群细胞显著增多;另外PCR结果显示纤维细胞活化标志物：Postn,Cilp,Prg4,Malat1,Meox1表达也上调，文献报道这些基因在sham组表达量较低，但在心肌梗死后显著上调，因此可能代表sham-CFs处于早期活化状态;心肌梗死后3天，F-CI亚群（活化的成纤维细胞）显著上调；RNAvelocity表明，F-CI亚群可能来自F-Cyc亚群。GO富集表明，心肌梗死后3天，cKO组F-Act和F-SH亚群细胞差异表达基因参与多条CFs增殖相关的pathway：MAPK-ERK1/2，FGFpathway.

6、Hif-1a缺失通过增加CFs数量促进post-MI纤维化

研究者发现，心肌梗死后第14天左心室中ECM和纤维化相关基因表达在cKO组上调；肌成纤维细胞相关标志物：a-SMA，及COLI、COLVI表达量也显著上调；相似的结果也在2D培养的tdTomato+CFs细胞观察到：TGFb1处理促进a-SMA表达；3D胶原凝胶分析提示，TGFβ1处理后，cKO和WT组细胞收缩力显著上调。因此，Hif-1a的缺失会可能通过增加心脏成纤维细胞的数量加剧心肌梗死后心脏的纤维化。这种纤维化的现象在体外培养的3D工程化心脏微组织中也被观察到。

7、在心肌梗死后Hif-1a抑制ROS介导的心脏成纤维细胞增殖在低氧情况下，Hif-1a通过调节代谢确保有效利用氧和能量，同时降低线粒体氧化应激。qRT-PCR检测心肌梗死后样本结果提示参与糖酵解、血管生成、氧化还原平衡的HIF-1靶标基因下调；流式细胞术检测sham和MI，心肌梗死后cKOCFs的ROS水平显著上调，进一步发现ROS主要富集在线粒体；体内注射靶向线粒体氧化剂（MitoPQ）研究发现，线粒体ROS上调进一步驱动CFs增殖，用靶向线粒体抗氧化剂（MitoT）处理后这一表型得到逆转。Dot免疫印迹分析显示，心肌梗死后tdTomato+CFs细胞的pAKT和pERK1/2蛋白水平上调，在cKO-MI组的表达进一步增强，MitoT处理后逆转pAKT和pERK1/2蛋白表达。体内进一步验证发现，MitoT可挽救心肌梗死后cKO小鼠的心肌纤维化和心室功能。

综上所述，该研究发现心肌成纤维细胞中HIF-1α通过AKT/MAPK信号通路调节线粒体中ROS的表达，从而调控心肌成纤维细胞的增殖，确保在心肌梗死情况下成纤维细胞不会过度增殖导致纤维化，作为关键的“刹车”机制确保心脏的安全，为心脏的安全防护提供了新的药物靶点和治疗方向。

参考文献：

JanbandhuV,TallapragadaV,PatrickR,LiY,AbeygunawardenaD,HumphreysDT,MartinEMMA,WardAO,ContrerasO,FarbehiN,YaoE,DuJ,DunwoodieSL,BursacN,HarveyRP.Hif-1asuppressesROS-inducedproliferationofcardiacfibroblastsfollowingmyocardialinfarction.CellStemCell.Feb3;29(2):-.e12.

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