玉素普·努尔麦麦提古丽尼格尔·艾尔肯王江
*医院麻醉科，乌鲁木齐
国际麻醉学与复苏杂志,,42(08):-.
DOI：10./cma.j.cn-0210?
基金项目
国家自然科学基金（）
REVIEWARTICLES
线粒体作为人体细胞的重要组成成分，传统认为线粒体只是能量提供中心，然而，线粒体还参与细胞的多种功能，包括钙稳态、活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）的产生、信号传递以及细胞凋亡的调控。在心肌细胞，1/3的细胞体积被线粒体占据，正常的线粒体是心肌细胞的“发动机”，满足心肌细胞的持续高能量需求。但心肌缺血/再灌注导致线粒体功能障碍及能量产生减少，钙超载和ROS产生过多，导致线粒体膜通透性异常，且通透性转换孔（mitochondrialpermeabilitytransitionpore,mPTP）开放，引起线粒体肿胀和破坏。除此之外，受损的线粒体释放大量细胞色素C，细胞色素C与凋亡相关的蛋白结合，诱发细胞凋亡。这些情况将功能障碍的线粒体转化为驱动心肌细胞不可逆性损伤的机制，因此，大量研究以线粒体作为治疗靶点，调节和抵消功能障碍的线粒体对心肌细胞的损伤。一直以来大部分研究和治疗主要局限在支持治疗上，因此，开发一种新的治疗策略至关重要。
最近越来越多的研究显示，线粒体能穿过细胞膜，可以在细胞水平上转移，并且研究证实将外源性线粒体移植到病变部位，能安全、有效地减轻缺血/再灌注损伤。线粒体移植是将未缺血组织来源的功能完整的线粒体通过各种途径输注到缺血病变部位，通过增加ATP的产生，替代受损线粒体和线粒体DNA，提高心肌细胞的活性及自我修复能力，从而减轻心肌缺血/再灌注损伤（myocardialischemia/reperfusioninjury,MI/RI）。这种技术成功绕过导致线粒体损伤的缺血间期，能有效减轻功能障碍的线粒体启动的心肌损伤，为保护MI/RI开辟了一条新的治疗途径。
1线粒体移植方法
1.1 线粒体分离和输注
1.1.1 线粒体分离
移植线粒体主要是从非缺血的胸大肌、腹直肌、腓肠肌、胸锁乳突肌、比目鱼肌等组织中分离获取，将组织置于蔗糖缓冲液，使用组织均质机进行组织均质化，然后加入枯草杆菌A，充分混合10min，将混合物通过预湿的不同规格网状过滤器过滤3次后，滤液在4°C下以g速度离心10min，去除上清液，将线粒体颗粒重新悬浮后放入呼吸缓冲液中，通过血细胞计数仪、透射电子显微镜、线粒体荧光探针、Clarke型电极、ATP检测试剂盒来测定分离的线粒体数量、纯度、活力和呼吸功能。这种分离方法用差异过滤代替了经典的差速离心法，避免了长时间、反复离心步骤，节省时间的同时减少了长时间离心对线粒体的损伤，简单、快速，一般在30min内可以分离出高纯度、有活力和呼吸能力强的线粒体，并且可以与手术同时进行，具有更好的临床实践性。
1.1.2 线粒体输注
线粒体移植方法有共培养法、显微注射法、血管输注法、雾化吸入法、蛛网膜下腔途径、小肽标记法、脂质体转染法、囊泡包装法、聚合物包装法等。
共培养法是将线粒体分离出来后，与目的细胞共同培养。Guo等发现，骨髓间充质干细胞与免疫荧光标记的线粒体共培养20h后，共培养的细胞内检测到免疫荧光标记的线粒体，并且线粒体的转移呈剂量依赖性，在限定的时间内共培养液中线粒体含量越多，转移到共培养细胞中的线粒体含量越高；而且与空白对照组相比明显促进了骨髓间充质干细胞的增殖、迁移；更重要的是与药物或生长因子等方法增强细胞活性的策略相比，共培养线粒体移植不改变细胞外微环境，避免产生细胞*素等安全问题，展现安全、稳定等优势。
显微注射法移植线粒体主要使用在单个细胞的线粒体移植，通过显微注射法将线粒体移植到卵母细胞，增强线粒体功能障碍或下降的卵母细胞功能，提高高龄患者体外受精成功率，然而其对操作技术的要求高，难度大。
血管输注法是通过循环系统将线粒体传送到靶器官，效率高、操作简单，血管输注途径可以选择动脉或静脉。研究显示，心肌缺血30min后，再灌注开始时从冠状动脉输注外源性线粒体，再灌注15min开始心肌收缩力明显改善，显著减轻心肌梗死面积，外源性线粒体可在心脏各处检测到，且主要分布在心肌细胞相邻区域或心肌细胞内，且对心肌的作用与病变区直接输注外源性线粒体组相比差异无统计学意义；与其他方法相比，这种移植方法更贴近于临床，更适合在冠状动脉旁路移植术或介入治疗中应用。
Moskowitzova等在大鼠急性肺损伤模型中通过雾化吸入法移植线粒体，在肺组织中检测到外源性线粒体，明显减少肺组织炎性细胞浸润和组织充血水肿，增强缺血2h后再灌注24h肺组织恢复，明显减轻肺损伤，并与血管输注外源性线粒体组相比差异无统计学意义。
另外一项研究发现，蛛网膜下腔出血后，在脑脊液中检测到线粒体，并提出脑损伤患者可以通过蛛网膜下腔途径移植线粒体。
除此之外，线粒体与肽载体结合转运，除了提高外源性线粒体渗透效率外，还可以缩短线粒体在细胞外暴露的时间，从而防止线粒体受细胞外微环境不利因素的影响；还可以把线粒体输送到脂质体或囊泡中，同样起到上述保护作用；但当需要移植大量的线粒体时存在一定的困难。为了提高线粒体稳定性，将右旋糖酐与三苯基膦结合的聚合物组装在线粒体表面，使线粒体处于代谢睡眠状态，有效保护线粒体呼吸功能，增强线粒体稳定性，延长线粒体在体内的保留时间。
1.2 线粒体内化和融合
研究显示，线粒体移植后10min内起到心肌保护作用，随后在细胞内检测到外源性线粒体，增加ATP生成，减少心肌梗死面积，并且这种保护作用至少维持4周。但线粒体内化和融合的机制尚未清楚，目前有几种假说解释线粒体内化的机制，如肌动蛋白介导的内吞作用、隧道纳米管、巨噬细胞吞噬作用等。Pacak等的研究中，线粒体与心肌细胞共孵育后，在心肌细胞中检测到内化的线粒体，为了探讨其内化的潜在机制，添加上述内化机制的特应性抑制剂，孵育4h后发现抑制隧道纳米管和巨噬细胞内吞作用不影响线粒体内化，只有抑制肌动蛋白介导的内吞作用才会降低心肌细胞的线粒体内化，并提示肌动蛋白介导的内吞作用可能是唯一的内化机制。
最近另外一项研究显示，隧道纳米管参与细胞间线粒体转移，将缺氧/复氧处理的心肌细胞与完整的心肌成纤维细胞共孵育时，线粒体沿着隧道纳米管转移到心肌细胞，减轻缺氧/复氧诱导的细胞凋亡；进一步研究发现微管、微管运动蛋白家族成员5B、F?肌动蛋白参与隧道纳米管中线粒体转移，F?肌动蛋白为隧道纳米管提供基本骨架，微管和微管运动蛋白家族成员5B负责线粒体转运，三者之间任何一个受损都会影响线粒体的转运。虽然大量研究显示，在靶细胞内检测到外源性线粒体，并且有明显的保护作用，但其内化的数量依然很少，大约占移植线粒体数量的3%~7%，有研究显示，右旋糖酐与三苯基膦结合的聚合物包裹线粒体能促进线粒体内化，聚合物包裹的线粒体分别在孵育4h和24h内化的数量均是对照组的3倍，这可能与带正电的聚合物及细胞膜上的负电荷相互作用来提高内化速度有关，此外，聚合物有很大的亲脂表面积，能穿过磷脂双分子层，也提高内化效率。
大部分外源性线粒体一旦进入细胞内就开始产生ATP或与内源性线粒体融合，并且替代或修复受损线粒体，小部分线粒体可能被溶酶体水解。有研究发现，丝裂蛋白1、丝裂蛋白2、视神经萎缩1蛋白等融合相关蛋白可能参与外源性线粒体与内源性线粒体的融合过程。内化和融合对于外源性线粒体挽救受损的靶细胞及靶器官至关重要，指导和发展线粒体治疗的意义重大，其确切的分子机制有待我们进一步研究。
2线粒体移植在心肌保护中的应用
2.1 线粒体移植与MI/RI
根据“年全球疾病负担研究”的流行病学数据，心血管疾病仍然是全球最常见的死亡原因，占全部死亡病因的31.5%。冠状动脉粥样硬化性心脏病是最常见的心血管疾病，在过去的几十年里，经皮冠状动脉介入和冠状动脉旁路移植术等策略使缺血心肌及时恢复再灌注，降低了冠状动脉粥样硬化性心脏病的病死率。然而，再灌注挽救心肌细胞的同时，不可避免地发生MI/RI。
在一项缺血/再灌注损伤动物模型研究中，通过夹闭冠状动脉左前降支30min再通建立MI/RI模型，再灌注之前在缺血区直接输注自体线粒体，恢复血液灌注2h、1d、3d、7d、14d、28d时检测各项指标，结果显示，再灌注2h后在心肌细胞内检测到内化的线粒体，线粒体移植组ATP合成明显高于缓冲液对照组，心肌梗死区肌酸激酶同工酶、心肌肌钙蛋白I、细胞凋亡相关因子、炎症因子、梗死面积明显少于缓冲液对照组，线粒体移植组恢复灌注28d的心肌梗死面积与再灌注2h相比无明显扩大；研究还表明，移植线粒体后未检测到急性移植排斥反应及免疫或者炎性反应相关的因子上调，未观察到心律失常等不良事件。更进一步研究显示，再灌注前从冠状动脉或局部输注外源性线粒体后，心肌细胞内检测到外源性线粒体，且明显改善心肌收缩功能，减少心肌梗死面积，且冠状动脉输注组与直接局部输注组之间心肌梗死面积差异无统计学意义，这表明血管输注自体线粒体同样能减少梗死面积，改善心肌功能，更适合在临床上应用。
另外一项研究中，研究者在缺血前从冠状动脉连续或者单次输注自体线粒体，输注15min后夹闭冠状动脉左前降支缺血30min，再灌注min，研究显示，与空白对照组相比，线粒体移植组心肌梗死面积明显减少，心肌功能增强，说明此方法起到了预防性保护MI/RI的作用，并且这种保护作用在单次输注和连续输注间差异无统计学意义，这可能预防高风险患者MI/RI所致的心衰，并且降低病死率。除此之外，在缺血/再灌注min后，延迟自体线粒体移植也起到了同样的心肌保护作用；有研究小组将这项技术首次应用于临床研究，5例缺血/再灌注导致心衰的患者移植自体线粒体，其中4例患者心功能明显改善，并成功脱离了体外膜肺氧合；随后，年该研究小组发表的一项单中心回顾性研究中，他们在心脏手术后需要体外膜肺氧合支持的10例患者移植自体线粒体，将这10例患者与14例未移植线粒体的历史对照组进行比较，结果显示，实验组患者心功能恢复更快，脱离体外膜肺氧合的成功率更高，心血管不良事件发生率更低，且无患者出现线粒体移植相关的短期不良事件。
上述研究结果表明，线粒体移植技术将来可能是一种有效预防和治疗MI/RI的新策略。
2.2 线粒体移植与心脏移植
心脏移植手术是内科治疗无效的心衰患者最后一根救命稻草，且移植手术的数量每年都在增加。然而，由于供心的稀缺，心脏捐赠与心脏移植需求之间存在严重的不平衡性，有数据显示，每年只有1/2需要心脏移植的患者接受移植，越来越多严重的冠状动脉粥样硬化性心脏病患者在无限期的等待合适供体，导致大量患者死亡。现阶段大部分的心脏移植供体是脑死亡患者捐赠的，这种严格的供体选择日益扩大心脏捐赠与移植需求间的差距。为了解决供体稀缺的问题，纳入一些潜在的供体是可行的策略，如长冷缺血时间供体、循环死亡供体等。从取出供体到移植手术之前，供体需要冷保存，此阶段称之为冷缺血时间（coldischemiatime,CIT），在低温状态下降低心脏基础代谢，保护心脏供体的同时心肌处在冷缺血状态，细胞及线粒体受损，并且再灌注以后发生缺血/再灌注损伤。CIT与心脏移植手术预后密切相关，研究显示，CIT4h是术后1个月和术后1年患者病死的独立危险因素。最近，Moskowitzova等报道，线粒体移植能减少CIT后的组织损伤，在他们的实验中，取老鼠心脏供体之前从冠状动脉注入移植线粒体，再灌注10min后取出供体冷保存29h，然后移植到受体老鼠，再灌注24h后的研究结果显示，与未行线粒体移植的心脏相比，接受线粒体移植的心脏射血分数和搏动分数有所改善，炎性反应和坏死明显减轻，心脏功能得以改善。
由于脑死亡心脏供体数量少，未能解决供体与受体之间的不平衡性，为了缓解这种趋势，人们对循环死亡后捐献（donatedaftercirculatorydeath,DCD）的研究再次燃起了兴趣。目前，在世界许多国家DCD数量逐渐增加。但是，循环死亡的心脏供体在循环停止及宣布死亡的过程中会产生热缺血期，热缺血期器官仍处于代谢状态，但缺血/缺氧导致器官受损，降低器官活性。有研究在猪DCD模型中，让心脏热缺血20min，再灌注15min后实验组移植自体线粒体，再灌注4h后结果显示，与热缺血后未输注线粒体的空白对照组相比，实验组心肌氧耗量显著增加，心肌梗死面积明显小于对照组，心功能明显改善。
总之，自体线粒体移植技术减轻长CIT或热缺血时间对心脏的损伤，改善心肌功能，减轻移植后心功能障碍，为潜在心脏供体的保护和增加捐赠数量提供了新的方案。
3总结
自体线粒体移植作为一种新的治疗策略，为缺血所致的线粒体障碍性疾病提供了新的治疗途径，但大部分研究集中在基础实验阶段，并有很多机制仍未解释清楚，包括：①线粒体如何穿过血管内皮以及如何进入细胞内；②细胞内内化的移植线粒体不到10%的情况下，如何满足细胞需求；③移植线粒体是否受微环境中ROS及其他不利因素的影响。随着研究的深入和技术的不断改进，相信这些问题会在不久的将来得以解决，自体线粒体移植的治疗策略也将广泛应用于临床治疗。
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