心肌缺血(MI)是对人类健康造成重大威胁的常见病，它呈现出以糖酵解代谢增强，葡萄糖有氧氧化被抑制和ATP生成减少为特征的能量代谢紊乱，因此调节能量代谢是心肌缺血预防和治疗的重要方面。银杏叶提取物(GinkgobilobaL.extract,GBE)在防治缺血性心脏病方面已广泛应用。
该研究采用稳定同位素示踪代谢流分析技术(MFA)和Seahorse技术对GBE发挥能量代谢保护作用的机制和物质基础开展深入研究。MFA技术将含13C、15N或2H的示踪剂引入生物系统，能够使下游代谢物同位素分布模式改变，通过液质联用分析(LC-MS)可检测这些代谢物随时间变化的同位素掺入比例和含量，确定代谢物的来源、速率和方向变化，实现对代谢过程更深入准确的了解。Seahorse技术是一种活细胞代谢实时监测技术，可以提供活细胞在正常和病理状态下的能量代谢表型，验证代谢位点和途径。
如图1所示，该研究采用Seahorse技术，筛选对异丙肾上腺素（ISO）损伤H9c2心肌细胞线粒体有氧呼吸障碍发挥调节作用的GBE单体，采用MFA技术研究损伤心肌细胞的能量代谢流的变化和紊乱特征，以及活性单体的调控作用及其确切调节代谢通路的节点。通过RT2profilerPCR和westernblotting分析调节代谢通路的节点上关键代谢酶的表达。最后，通过大鼠体内实验进一步验证。
图1研究工作流程
1、异丙肾上腺素诱导缺血样心肌细胞的TCA循环代谢流发生紊乱
以[U-13C]葡萄糖为示踪剂，研究ISO损伤H9c2细胞的能量代谢紊乱。如图2A所示，糖酵解通路中碳源[U-13C]葡萄糖产生的代谢物被标记为m+6或m+3，而TCA循环中碳源[U-13C]葡萄糖产生的代谢物被标记为m+2。如图2B所示，经[U-13C]葡萄糖培养后，与对照组相比，模型组细胞的TCA循环上游代谢物的13C标记比例显著增加，包括柠檬酸/异柠檬酸和顺式乌头酸，而TCA循环下游代谢物的13C标记比例显著降低，包括α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸和天冬氨酸(代表草酰乙酸)。表明细胞损伤后，进入TCA循环的碳源葡萄糖增加，但在异柠檬酸和α-酮戊二酸之间代谢受阻。
柠檬酸m+2/丙酮酸m+3比值代表丙酮酸脱氢酶（PDH）和/或柠檬酸合成酶(CS)活性，天门冬氨酸m+3/丙酮酸m+3比值代表丙酮酸羧化酶（PC）活性，α-酮戊二酸m+2/异柠檬酸m+2比值代表异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)活性。如图2C所示，损伤后PDH和/或CS活性增强，PC活性无明显变化，IDH2活性受到抑制。
13C标记和未标记代谢物的细胞总浓度代表了不同碳源对代谢物的综合贡献。如图2D所示，与对照组相比，模型组细胞的TCA循环中大部分代谢物的总浓度明显升高，并且上游代谢物(柠檬酸/异柠檬酸和顺式乌头酸)的升高幅度大于下游代谢物(琥珀酸、富马酸和苹果酸)。虽然损伤后琥珀酸、富马酸、苹果酸的13C标记比例显著降低，但它们的细胞总浓度均升高。如图2A所示，谷氨酰胺可作为重要碳源进入TCA循环，补充下游代谢物，谷氨酰胺氧化代谢的增强稀释了这些下游代谢物的13C标记比例。此外，损伤后细胞内糖酵解产物乳酸总浓度升高，说明缺血损伤后糖酵解作用增强。损伤后细胞内丙酮酸总浓度升高，但其13C标记比例降低，推测脂质代谢和氨基酸代谢产生的丙酮酸增加。
图2ISO损伤和白果内酯保护对H9c2心肌细胞能量代谢流的影响
(A)[U-13C]葡萄糖代谢示意图；(B)H9c2细胞能量代谢通路中各代谢物的13C标记比例；(C)通过上下游代谢物13C标记比计算PDH/CS、PC/CS和IDH2活性；(D)H9c2细胞能量代谢通路中各代谢物的总浓度
2、GBE单体对损伤心肌细胞线粒体有氧呼吸的调节作用
CCK-8实验结果显示，GBE中的白果内酯、银杏内酯B、山柰酚和芦丁对受损心肌细胞有明显的保护作用（图3A）。Seahorse实验结果显示ISO损伤显著降低了心肌细胞的基础呼吸值、ATP产生量和最大呼吸值(图3B和图3C)。而白果内酯和芹菜素能够提高损伤细胞的基础呼吸值和ATP产生量，白果内酯、银杏内酯B和芹菜素能够显著提高损伤细胞的最大呼吸值。综合上述实验数据发现，白果内酯对心肌细胞有明显的线粒体呼吸保护作用。
图3ISO损伤和白果内酯保护对H9c2心肌细胞线粒体有氧呼吸的影响
(A)ISO和GBE单体对H9c2细胞存活率的影响；(B)经ISO和GBE单体处理的H9c2细胞的基础呼吸值、ATP产生量和最大呼吸值；(C)经ISO和白果内酯处理的H9c2细胞的线粒体呼吸活性
3、白果内酯显著改善损伤心肌细胞的TCA循环代谢流紊乱
如图2A和图2B，与模型组相比，白果内酯处理后的损伤细胞表现出TCA循环上游代谢物的13C标记比例显著降低，下游代谢物的13C标记比例显著增加，表明白果内酯能够促进累积的柠檬酸/异柠檬酸和顺式乌头酸的代谢转化，进入下游通路，调节了TCA循环的代谢流。这与关键代谢酶的活性变化有关。如图2C所示，白果内酯处理后PDH和/或CS活性降低，IDH2活性增加。如图2D所示，白果内酯显著降低了TCA循环代谢物的细胞总浓度，表明损伤细胞经过白果内酯保护后，减少了其他碳源流入TCA循环下游，维持了TCA循环代谢的平衡。
4、与损伤和白果内酯活性有关的能量代谢关键酶
如图4所示，与对照组细胞相比，模型组的损伤细胞的许多能量代谢酶基因表达上调，mRNA表达水平升高，包括PDH、CS、SUCLG(琥珀酸辅酶A连接酶)和SDH(琥珀酸脱氢酶)，PDH和CS蛋白表达水平显著升高，与MFA结果一致。同样，损伤细胞SUCLG和SDH表达水平升高，与琥珀酸和富马酸细胞总浓度的变化一致。但是，IDH2表达水平未见明显变化，并与活性试验结果一致。这可能是因为IDH2是TCA循环的限速酶，虽然在损伤细胞中的表达水平和活性未发生变化，但上游PDH和CS发生了显著增强造成上游代谢物大量积累，IDH2不能迅速将它们释放到下游，从而造成TCA循环代谢流的阻碍。
在白果内酯处理组的损伤细胞中，PDH、CS、SUCLG、SDH等关键代谢酶的mRNA表达水平均低于模型组细胞，蛋白表达水平也显著降低，与MFA结果一致。虽然白果内酯没有改变IDH2的表达和活性，但降低了上游PDH和CS和下游SUCLG和SDH的表达水平，降低了代谢物的积累和对IDH2的压力。因此，PDH、CS、SUCLG、SDH，特别是PDH和CS是ISO损伤影响的关键代谢酶，白果内酯通过调控它们的表达水平来改善TCA循环的代谢流紊乱，维持了TCA代谢平衡。
图4与损伤和白果内酯活性有关的能量代谢关键酶的表达变化
(A)能量代谢酶基因表达水平热图；(B)部分能量代谢酶的mRNA表达水平；(C)IDH2的活性；(D)部分能量代谢酶的蛋白表达水平
5、白果内酯对心肌缺血大鼠受损TCA循环的保护作用
研究者进一步在心肌缺血模型大鼠中验证了白果内酯对TCA循环的保护作用。如图5A至5C所示，通过心肌酶CK-MB水平、组织病理学检查证明了ISO诱导的心肌缺血大鼠模型建立成功，以及不同剂量白果内酯对心肌缺血大鼠的心脏保护作用。
图5D展示了对照组、模型组和不同剂量白果内酯给药组大鼠心肌组织的靶向代谢组学研究结果。与对照组相比，模型组心肌中柠檬酸/异柠檬酸、顺式乌头酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、谷氨酸、丙酮酸和乳酸含量明显升高，尤其是上游的柠檬酸/异柠檬酸、顺式乌头酸，与细胞实验结果一致。与模型组相比，白果内酯组心肌中上述代谢物的含量明显降低，尤其是在20mg/kg的剂量下，说明白果内酯减少了TCA循环中代谢物的累积，改善了TCA循环代谢流受阻的状态，也与细胞实验结果一致。如图5E所示，模型大鼠心肌组织中PDH、CS、SUCLG、SDH的蛋白表达水平显著升高，而在20mg/kg白果内酯给药组大鼠的心肌组织中上述蛋白的表达水平显著降低，与靶向代谢组学和细胞实验结果一致。
图5白果内酯对心肌缺血大鼠受损TCA循环的保护作用
(A)大鼠血浆中心肌酶CK-MB含量；(B)心肌组织病理学检查；(C)大鼠心肌组织病变分级；(D)大鼠心肌能量代谢通路代谢产物含量；(E)大鼠心肌PDH、CS、SUCLG、SDH蛋白表达水平
6、白果内酯保护缺血心肌细胞能量代谢的机制
综上，ISO损伤缺血样心肌细胞表现出碳源葡萄糖从糖酵解到TCA循环的代谢流受阻，其他碳源进入TCA循环增强。GBE中的单体白果内酯能够有效调节损伤心肌细胞的线粒体有氧呼吸，白果内酯通过降低受损细胞中关键代谢酶的表达，显著调节TCA循环代谢流，减少了上游代谢物的异常积累，平衡了TCA循环对不同碳源的需求。该研究进一步证明了心肌缺血的病理代谢机制，并且白果内酯作为GBE的活性化合物之一，也诠释了GBE心肌保护作用的物质基础。本研究还显示出MFA和Seahorse技术可为代谢组学的拓展研究提供手段，为中草药作用物质基础和机制研究提供新的研究策略。
图6白果内酯保护缺血心肌细胞能量代谢的机制
本文文献
ZheWang,FanZhang,WeiLiu,NingSheng,HuaSun,JinlanZhang.Impairedtricarboxylicacidcyclefluxandmitochondrialaerobicrespirationduringisoproterenolinducedmyocardialischemiaisrescuedbybilobalide[J].JournalofPharmaceuticalAnalysis,,doi.org/10./j.jpha..08..
原文作者：ZheWang,FanZhang,WeiLiu,NingSheng,HuaSun,JinlanZhang.
文献整理：王喆；编辑：生宁、张金兰；第期
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