北京雀斑医院地图 https://m-mip.39.net/disease/mip_9402310.html免疫检查点抑制剂引起的心脏*性是最致命的不良反应之一，因此，潜在机制的研究对于制定治疗策略具有重要的临床意义。年1月，医院杨静和周晓阳教授的研究团队在JournalofExperimentalClinicalCancerResearch期刊（IF:11.）上发表了题为“PrevotellaceaeproducesbutyratetoalleviatePD-1/PD-L1inhibitor-relatedcardiotoxicityviaPPARα-CYP4X1axisincolonicmacrophages”的研究论文，旨在研究微生物与宿主的相互作用是否有助于缓解PD-1/PD-L1抑制剂引起的心脏*性。文章中的16SrRNA微生物多样性检测服务由欧易生物提供技术支持。
研究背景
靶向程序性细胞死亡1(PD-1)或其配体1(PD-L1)的免疫检查点抑制剂在抗肿瘤治疗中具有重要的临床意义，但会引起致命的免疫不良反应——心脏*性。为了克服这一不良反应，必须尽量减少全身炎症。改变肠道微生物群落在心血管疾病的炎症反应中起着重要作用。肠道微生物代谢产物短链脂肪酸(SCFAs)，如丁酸，具有抗炎特性。然而，控制肠道菌群及其代谢产物，是否能阻止PD-1/PD-L1抑制剂诱导的心肌细胞凋亡和心脏*性尚不清楚。
巨噬细胞是自身免疫和自身炎症疾病中炎症介质的主要生产者。前期研究表明，抑制细胞色素P(CYP)4X1使肿瘤相关巨噬细胞重新分化为M1表型，并上调M1样因子TNF-α和IL-1β。然而，CYP4X1和结肠巨噬细胞衍生的M1样因子TNF-α和IL-1β是否与PD-1/PD-L1抑制剂相关的心脏*性有关尚不清楚。
研究内容
在本研究中，首次提供了PD-1/PD-L1抑制剂以肠道微生物群依赖的方式诱导心肌细胞凋亡和心脏*性的直接证据。P.loescheii定植和补充丁酸对PD-1/PD-L1抑制剂引起的心脏*性有保护作用。此外，还发现PD-1/PD-L1抑制剂诱导的肠道菌群失调可上调结肠巨噬细胞中促炎因子IL-1β和TNF-α的表达。这是首次证实肠道微生物群和结肠巨噬细胞在PD-1/PD-L1抑制剂引起心脏*性中的相互作用。
研究结果
1.BMS-1诱导黑色素瘤小鼠心肌细胞凋亡和心脏*性
PD-1/PD-L1抑制剂BMS-1(5和10mg/kg)处理的小鼠的食物摄入量与对照组相比呈现下降趋势，但三组之间没有显著差异(图1A)。BMS-1(5和10mg/kg)降低了小鼠的体重，但增加了心脏/体重的比值(图1B)。脑钠肽(BNP)是心脏功能失常的指标，BMS-1(10mg/kg)显著提高了BNP水平(图1C)。BMS-1处理小鼠外周血中CK-MB、AST、CK和LDH等心肌酶活性也得到了类似的结果(图1D)。此外，BMS-1(10mg/kg)显著降低了抗凋亡蛋白HAX-1和Bcl-2的水平，但增加了促凋亡蛋白Bax、cleavedcaspase3和cleavedcaspase9的水平(图1E)。与对照组相比，BMS-1(5和10mg/kg)也增加了心肌组织中的炎症浸润、间质纤维化和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)阳性心肌细胞的数量(图1F-H)。BMS-1(5和10mg/kg)抑制黑色素瘤的生长，可以通过降低肿瘤重量和荧光素酶强度来证明(图1I和J)。这些结果表明，PD-1/PD-L1抑制剂BMS-1诱导黑色素瘤小鼠心肌细胞凋亡和心脏*性。
图1BMS-1诱导黑色素瘤小鼠心肌细胞凋亡和心脏*性
2.BMS-1诱导黑色素瘤小鼠肠道黏膜屏障损伤
肠屏障功能障碍包括机械屏障(肠黏膜上皮)和生物屏障(肠道微生物群)损伤导致心功能受损。对结肠黏膜完整性进行评估。如图2所示，BMS-1(5和10mg/kg)降低了结肠组织绒毛高度和杯状细胞数量，并下调了紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1的表达。测定肠系膜灌注评分，发现BMS-1(5和10mg/kg)降低了肠系膜灌注(图2E)。这些结果表明BMS-1诱导黑色素瘤小鼠肠道黏膜屏障损伤。
图2BMS-1诱导黑色素瘤小鼠肠道屏障损伤
3.肠道微生物菌群失调有助于PD-1/PD-L1抑制剂引起的心脏*性
对粪便中的细菌16SrRNA进行测序，以评估肠道生物屏障。虽然BMS-1(5和10mg/kg)对粪便总菌量或种类没有显著影响(图3A)，但beta分析显示肠道菌群构成存在明显差异，尤其是BMS-1(10mg/kg)组与对照组之间(图3B)。alpha多样性分析也表明，Shannon指数降低，但不影响Chao指数和Sobs指数(图3C和D)。图3E显示BMS-1显著改变了菌门的丰度。厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的比值(肠道失调的标志)在BMS-1作用下显著增加(5和10mg/kg)(图3F)。通过LEfSe分析确定差异表达菌(图3G)。在门水平，BMS-1(5和10mg/kg)处理显著降低了拟杆菌属的丰度。相反，与对照组相比，BMS-1(10mg/kg)处理小鼠的厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)的丰度显著增加。
在属水平上，与对照组相比，在BMS-1(10mg/kg)处理的小鼠中观察到Prevotellaceae和Rikenellaceae属的缺失和Escherichia-Shigella的富集。与对照组相比，BMS-1(5mg/kg)处理的小鼠Ruminococcaceae属的丰度显著增加，BMS-1(10mg/kg)与对照组之间没有显著差异(图3H)。为了探究肠道菌群在BMS-1诱导的心脏*性中的作用，进行了粪菌移植（FMT）实验，用BMS-1(5,10mg/kg)处理的小鼠的肠道菌群进行了肠道菌群的重建(图3I)。令人意外的是，BMS-1处理的小鼠FMT显著诱导了心肌酶(CK-MB、AST、CK和LDH)的泄露和心肌细胞的凋亡(图3J和K)。结果表明，肠道微生物菌群失调有助于PD-1/PD-L1抑制剂引起的心脏*性。
图3肠道微生物失调导致PD-1/PD-L1抑制剂引起的心脏*性
4.P.loescheii定植和补充丁酸盐可减轻PD-1/PD-L1抑制剂引起的心脏*性
通过KEGG通路分析，检测肠道菌群中功能基因的相对丰度。与对照组相比，BMS-1(10mg/kg)处理的小鼠的脂肪酸合成途径显著下调(图4A)。测定了BMS-1和对照组小鼠的粪便中SCFAs，发现BMS-1(5和10mg/kg)显著降低了丁酸水平，而乙酸、丙酸、戊酸和己酸保持不变(图4B)。向BMS-1(10mg/kg)处理的小鼠提供P.loescheii或丁酸(图4C)，粪便中P.loescheii(图4D)和丁酸盐水平的增加证实了P.loescheii定植的有效性(图4E)。P.loescheii定殖和添加丁酸盐可减弱BMS-1诱导的心肌酶泄露和心肌细胞凋亡(图4F和G)。这些数据表明，P.loescheii定殖和添加丁酸盐可减轻PD-1/PD-L1抑制剂引起的心脏*性。
图4P.loescheii定植及补充丁酸可减轻PD-1/PD-L1抑制剂引起的心脏*性
5.M1样结肠巨噬细胞及其因子IL-1β和TNF-α有助于减轻PD-1/PD-L1抑制剂引起的心脏*性
BMS-1(5和10mg/kg)显著增加了M1样(CD68+iNOS+)细胞的数量，上调了M1基因(iNOS和CXCL9)，但降低了M2样(CD68+CD+)细胞的数量和下调了M2基因(CD和Arg-1)(图5A-D)。此外，BMS-1显著提高了结肠巨噬细胞中IL-1β和TNF-α的水平，但没有提高TGF-β和IL-10的水平(图5E)。为了确定BMS-1是否通过改变结肠巨噬细胞表型诱导心脏*性，用抗CSF-1抗体(IgG作为对照)清除结肠巨噬细胞(图5F)。如图5G和H所示，抗CSF-1抗体显著降低了BMS-1(10mg/kg)处理小鼠外周血心肌酶(CK、LDH、CK-MB和AST)水平和心肌组织中TUNEL阳性细胞数量。用IL-1β和TNF-α抗体来阻断它们的作用(图5I)，发现抗IL-1β或抗TNF-α抗体部分消除了BMS-1诱导的心脏*性。重要的是，IL-1β和TNF-α联合阻断比单独阻断更能减轻PD-1/PD-L1抑制剂引起的心脏*性(图5J和K)。结果表明，结肠巨噬细胞来源的M1样因子IL-1β和TNF-α有助于减轻PD-1/PD-L1抑制剂诱导的心肌细胞凋亡和心脏*性。
图5M1样结肠巨噬细胞及其因子IL-1、β和TNF-α有助于减轻PD-1/PD-L1抑制剂引起的心脏*性
6.P.loescheii定植以及添加丁酸可下调结肠巨噬细胞IL-1β和TNF–α
P.loescheii定殖和丁酸的补充抑制了BMS-1诱导的结肠组织中M1样(CD68+iNOS+)细胞数量的增加和M2样(CD68+CD+)细胞数量的减少(图6A)。P.loescheii定殖和添加丁酸可下调M1基因(iNOS和CXCL9)的mRNA表达，但上调M2基因(CD和Arg-1)的表达(图6B)。还观察到结肠巨噬细胞M1样因子(IL-1β和TNF-α)和M2样因子(TGF-β和IL-10)水平的类似改变(图6C)。结果表明在PD-1/PD-L1抑制剂引起的心脏*性反应中，P.loescheii定植和丁酸可以阻止结肠巨噬细胞M1样极化和促炎因子IL-1β和TNF-α的产生。
图6P.loescheii定植及补充丁酸下调结肠巨噬细胞IL-1β和TNF-α的表达
7.丁酸通过PPARα激活阻止NF-κB介导的M1样极化和心肌细胞凋亡
研究发现BMS-1(5和10mg/kg)显著降低了结肠巨噬细胞PPARα的表达(图7A)。为了检测PPARα在结肠巨噬细胞极化和心肌细胞凋亡中的作用，通过westernblot和qPCR检测GW抑制PPARα表达的效果(图7B)。图7C-F所示，丁酸能抑制LPS诱导的PNMS和RAW.7细胞中p-p65、TNF-α和IL-1β的上调，并能减少TUNEL阳性的HL-1心肌细胞的数量。而PPARα拮抗剂GW则破坏了丁酸的保护作用。PPARαsiRNA沉默实验的类似结果证实，丁酸可以通过PPARα依赖的方式阻止LPS诱导的M1样极化和心肌细胞凋亡(图8A-F)。此外,发现抗IL-1β或抗TNF-α抗体部分消除了LPS诱导的心脏*性。心肌酶水平下降，TUNEL阳性心肌细胞数量减少。重要的是，IL-1β和TNF-α联合阻断比单独阻断效果更好(图8G-I)。这些结果表明，丁酸通过PPARα的激活，阻止NF-κB介导的M1样极化和心肌细胞凋亡。
图7丁酸盐通过激活PPARα阻止NF-kB介导的M1样极化和心肌细胞凋亡
图8丁酸盐通过激活PPARα阻止NF-kB介导的M1样极化和心肌细胞凋亡
8.通过PD-1/PD-L1抑制剂下调CYP4X1可使PPARα失活，并在结肠巨噬细胞中形成正反馈环
检测了CYP4X1在结肠巨噬细胞中的表达。如图9A所示，BMS-1(5和10mg/kg)显著降低了结肠巨噬细胞CYP4X1的表达。与对照组相比，BMS-1(5和10mg/kg)处理的小鼠结肠巨噬细胞中来自CYP4X1的14,15-EET-EA的催化产量显著降低(图9B)。用BMS-1(10mg/kg)处理WT和Cyp4x1/小鼠，图9C和D所示，与WT小鼠相比，Cyp4x1/小鼠结肠巨噬细胞中14,15-EET-EA产量减少，TNF-α和IL-1β的分泌增加。此外，在Cyp4x1/小鼠中观察到更多TUNEL阳性的心肌细胞和更高水平的血清心肌酶(CK、LDH、CK-MB和AST)(图9E和F)。PPARαsiRNA下调了CYP4X1，反过来，CYP4X1敲除又下调了结肠巨噬细胞中PPARαmRNA和蛋白的表达(图9G)。外源性添加14,15-EET-EA显著降低PNMS中PPARα的表达，增加IL-1β和TNF-α的产生，从而逆转BMS-1诱导的心肌细胞凋亡(图9H-K)。这些结果表明，PD-1/PD-L1抑制剂下调CYP4X1可使PPARα失活，并在结肠巨噬细胞中形成正反馈环。
图9PD-1/PD-L1抑制剂下调CYP4X1使结肠巨噬细胞PPARα失活并形成正反馈环
研究结论
本研究表明，肠道菌群失调通过下调结肠巨噬细胞PPARα-CYP4X1轴，诱导产生的少量丁酸有助于减轻PD-1/PD-L1抑制剂引起的心脏*性。研究确认了肠道微生物群和结肠巨噬细胞之间在PD-1/PD-L1抑制剂引起的心脏*性中的交流。提出了一种新的PD-1/PD-L1抑制剂相关心脏*性的作用机制，并为通过控制肠道微生物群及其代谢产物丁酸酯使免疫治疗更安全、更有效提供了一个值得
